贛南臍橙是對外貿易中頗具競爭力的農產品， 它具有口感好，營養物質豐富等優點。自2000年 以來，贛南臍橙的種植面積逐漸擴大，其病害問題也 接踵而至，尤為嚴重的是柑橘黃龍病（Citrus Huanglongbing，HLB）。HLB 病原菌有三個種，流行最 廣 的 是 亞 洲 種（Candidatus liberibacter asisaticus， Las），該病主要通過木虱和苗木調運進行傳播。 HLB 的常見癥狀為黃梢、葉斑駁黃化和紅鼻子果， 該病癥狀很容易與其他柑橘病害混淆，例如柑橘衰 退病染和缺素癥。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗地點與品種

本研究中柑橘黃龍病監測 點在江西贛州市尋烏縣吉譚鎮果園，該果園面積約 為6 hm2 ，品種均為臍橙，樹齡是10 a左右，果園所處 地貌是為南方常見丘陵地形。當地果農嚴格施藥， 對木虱進行嚴格防控，調查未發現木虱。

1.1.2 引物與探針

參照 Li 等設計的引物 HLBas/HLBr 和探針 HLBr，以此結合本實驗室條件建 立 TaqMan 熒光定量檢測體系。此外使用 M13F/ M13R驗證含有目的片段載體的陽性克隆。引物和 探針由北京六合華大基因科技有限公司合成，引物 和探針詳情。

1.1.3 試劑耗材及儀器

實驗中所用試劑包括植物全基因組 DNA 提取試劑盒（Axygen，美國），質粒小 提試劑盒（Axygen，美國），Mpbio Fastprep Lysing A 裂 解 介 質 管（Axygen，美 國 ），DEPC 水（DNase/ RNase-Free/water）（北京索萊寶科技有限公司，中 國），Probe qPCR Mix（寶日醫生物技術（北京）有限 公司 ，中國），LB 培養基（Tryptone 15 g，Yeast extract 10 g，NaCl 10 g，pH 7.0），無水乙醇（國藥集團 化學試劑有限公司，中國），PBS緩沖液（HyClone，美 國）等。實驗所用儀器有普通離心機（Eppendorf，德 國），PCR 儀 和 凝 膠 成 像 分 析 系 統（美 國 ，BIORAD），超低溫冰箱 MDF-382E（SANYO，日本）與恒 溫冰箱（海爾，青島），QuantStudio® 6 Flex及核酸蛋 白分析儀（Thermo Fisher Scientific，美國），美國 MPFastPrep-24 5G 研磨機（MP Biomedicals，美國），微 孔板離心機（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，中 國）等。

1.2 方法

1.2.1 病害情況調查方法

本實驗根據袁亦文等2010年制定的柑橘黃龍病病情分級標準，將果園分 為 5 個病級，其中 1 級：樹上有 5~6 梢葉片呈現斑駁 黃化癥狀；2級：部分側枝或者主枝出現斑駁黃化癥 狀，占全樹的三分之一以下；3 級：帶有斑駁黃化葉 的側枝或主枝占全樹的 1/3~2/3；4 級：帶有 HLB 癥 狀樹枝占三分之二以上；5級：全樹接近死亡。從1~ 5級區分別選取5株樹，共25株樹。

1.2.2 植物組織總DNA提取

稱取約 100 mg柑橘 葉片中脈，切碎后裝入Mpbio Fastprep Lysing A裂解介質管，加入 500 mL PBS 緩沖液，用 MP FastPrep24 5G 研磨機研磨，程序設置：speed 6 m·s -1 ，time 40 s，Quantity 100 mg，cycles 2，pause time 300 s。植物 總 DNA 試 劑 盒 提 取 方 法 參 照 Axygen® 的 Multisource Genomic DNA Miniprep kit 250-prep 說明書， 將提取的DNA放入-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 質粒標準品的制備

由北京六合華大科技公 司將HLBas/HLBr擴增片段連接到pUC57-simple載 體上 ，再轉化進入大腸桿菌中 ，使用引物 M13F/ M13R進行50 mL體系的PCR驗證，驗證有條帶的陽 性菌液送至華大基因公司進行測序 ，利用 DNAMAN比對驗證。取陽性菌液，利用質粒小提試劑盒 提取質粒。

1.2.4 質粒模板拷貝數計算公式

使用核酸蛋白分 析儀測定核酸濃度，將其作為 Las 質粒標準品。將 DNA 的質量濃度轉化為模板拷貝數（copy number， CN）:CN=（M×N）（/ L×D），M=質量濃度（g · mL- 1 ）= DNA（ng · mL- 1 ）×10- 6 ，N=阿伏伽德羅常數（6.022× 1023分子/摩爾），L=核酸分子長度（總長度=靶片段+ 載體，單位 kb），D=轉換因子（對 dsDNA 為 6.6×105 g·mol-1 ·kb-1 。

2 結果與分析

將 HLBas/HLBr 擴增片段連接到 pUC57-simple 上得到載體pUC57-Las，使用引物M13F/M13R擴增 得到 211 bp特異條帶。測序后使用 DNAMAN進行 序 列 比 對 ，與 Las 基 因 組 中 相 應 序 列 相 似 性 為 100%，驗證結果正確。標 準 曲 線 y=- 3.369 lg（x）+ 15.738（R2 =0.999， Eff%=98.068）。 y 為 CT 值 ，x 為 DNA 濃 度 ，單 位 ng · mL-1 。將 DNA 濃度轉化模板拷貝數，得到公式 Y=−3.369 lg（CN）+44.422（Y 為 CT 值，CN 為模板拷 貝數）。

3 討 論 

對江西省贛州地區柑橘黃龍病菌在染病 柑橘樹體內的流行動態規律進行了監測，發現在 2017 年 8 月到 2018 年 10 月，Las 在樹體內的含量會 隨著時間變化而波動大體呈現出 2個高峰和 2個低 谷，總體表現為 2017 年 8 月開始 Las 含量先增后降的變化規律。胡浩研究了廣西柳州地區染病柑橘 樹內 Las含量的動態變化，結果顯示在 10 月柑橘黃 龍病菌含量達到最高值，在 3 到 5 月維持在較低水 平。Wang等研究顯示Las在染病柑橘樹體內變化 規律為在 10月和 12月柑橘黃龍病菌含量達到最高 值，3月和5月維持在較低水平。以上研究均發現在 10月份病樹內的 Las含量會達到高峰，5月 Las含量 處于低谷，但本研究中江西柑橘果園內病樹的 Las 含量在 6 月也呈現出 1 個高峰。該時段的 Las 含量 較 10 月份的 Las 含量低，但仍是低谷時期 Las 含量 的 10 倍以上。本研究的結果與前人研究結果存在 差異的原因可能是不同果園地理位置氣候或者柑橘 自身生長規律的差異導致的。此外本研究果園里的 木虱受到果農嚴格控制，定期施藥，所以木虱對植株 體內 Las 的含量影響較小，與前人的研究結果相互 對比分析，木虱對病樹后期 Las 含量的變化影響不大。



 

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