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多重PCR快速檢測方法研究(其林貝爾MTH-012使用)

返回列表 來源:未知 發布日期:2019-11-26 09:18【

近年來,食源性疾病屢見不鮮,其中主要的食源 性致病菌有沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌和 蠟樣芽孢桿菌等,可導致腹瀉、嘔吐、痢疾等多種疾病,嚴重者可造成死亡,因此,食品產品中要求不得檢出。 常規微生物學方法檢測食源性致病菌,通常需要經過 富集培養、形態觀察、生理生化鑒定等的過程,耗時耗 力,且主觀性強,極易導致樣品菌種的流失,出現陰性 結果,不能及時的發現并控制潛在的危險。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

蠟樣芽孢桿菌 (CMCC63302)、金黃色葡萄球菌 (CMCC26003)、宋內氏志賀氏菌(CMCC51334)、鼠傷 寒 沙 門 氏 菌 (CMCC50115)、 大 腸 埃 希 氏 菌(CM- CC44752)、銅綠假單胞菌(CICC21636)、蘇云金芽孢桿 菌(CICC22945)、綠膿桿菌(CMCC10110)、阪崎腸桿菌 (ATCC51024)、副溶血性弧菌(CICC21617)、變形桿菌 (CMCC49027)、單增李斯特菌(CMCC54001),均保存 于河北農業大學生物工程實驗室。 1.1.2 試劑 營養肉湯培養基:北京陸橋生物技術有限公司;瓊脂糖:北京全式金生物公司;agar:索萊寶生物科技有 限公司;細菌基因組 DNA 提取試劑盒:天根生化科技有限公司;2×Es Taq MasterMix(Dye):康為世紀生物科 技有限公司;50 bp DNA Ladder:中科瑞泰生物科技有 限公司;ddH2O:河北農業大學生物工程實驗室制備。

1.2 儀器與設備

其林貝爾MTH-012 型旋渦混合儀:海門其林貝爾儀器制造有限公司;070-851 型 PCR 儀:德國 Biometra 公司; DYY-10 C 型電泳儀:北京市六一儀器廠;JY04S-3E 型 凝膠成像分析系統:北京科普爾科技發展有限公司; UV-1700 型紫外分光光度計:上海優尼科公司;K5500 型超微量核酸測量儀:北京凱奧科技發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的培養

分別挑取蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀 氏菌、沙門氏菌的單菌落,接種于 8 mL 滅菌的營養肉 湯培養基,37 ℃搖床 180 r/min 過夜培養。

1.3.2 模板的制備及計數

取 1 mL 過夜培養菌液,提取基因組 DNA 為模板, 具體操作方法見細菌基因組 DNA 提取試劑盒說明書。 用核酸測定儀對 DNA 濃度及純度進行測定。另取 1 mL 菌液,10 倍梯度稀釋,涂布于固體肉湯培養基中, 37 ℃過夜培養,進行平板計數。

1.3.3 引物的設計與合成

針對蠟樣芽孢桿菌的 gyrB、nheA 基因,金黃色 色葡萄球菌的 nuc、SED、MecA基因、志賀氏菌的 ipaH 基因和沙門氏菌的 ttr、sal、SiiA 基因,共設 計了 11 套引物,引物由上海生工公司合成,引物序列 及擴增片段長度等。

1.3.4 引物的篩選和確定

以11對引物分別對 4 種目的菌進行擴增,單一PCR 反應體系為:2×Es Taq Master Mix(Dye) 5 μL、20 μmol/L 上 下 游 引 物 各 0.2 μL,DNA 模 板 0.8 μL,加 ddH2O 補足到 10 μL。單一 PCR 反應程序 為:94 ℃預變性 5 min,94 ℃ 變性 30 s,梯度設置退火 溫度,退火 30 s,72 ℃ 延伸 30 s,72 ℃再延伸 7 min,反 應 30 個循環。對 PCR 產物進行凝膠電泳分析,選擇擴 增條帶單一且大小不同、退火溫度相似的引物,確定 為多重 PCR 引物組。

2 結果與分析

蠟樣芽孢桿菌 gyrB 引物對在 52.5、55.7 ℃范圍內條帶明顯,片段長 246 bp;金黃色葡萄球 菌 nuc 引物對在 52.5 ℃處有單一明亮條帶,片段長 166 bp;志賀氏菌的 ipaHⅠ引物對在 52.6 ℃處單一明 亮條帶,片段長 210 bp,ipaH Ⅲ引物對在退火范圍內 條帶單一,片段長 65 bp;沙門氏菌 SiiA 引物對在梯度 退火溫度下條帶單一明亮,片段長 107 bp,退火溫度 相近且擴增出的片段長度不同,有利于多重 PCR 擴 增結果的判斷,最終選擇 gyrB、nuc、ipaHⅢ、SiiA 引物 對為多重 PCR 反應的引物組。當退火溫度在這個范圍內間均能得 到 4 條目的帶,且條帶區間明顯,故證明本研究建立的 多重 PCR 體系,可特異性擴增出目的條帶,且其大小 與預期擴增基因片段大小一致,但在 53.9 ℃之前條帶 略暗,退火溫度為 53.9 ℃ 時條帶更加清晰明亮,因此,選定 54 ℃作為多重 PCR 的最適退火溫度。但多重 PCR 擴增的志賀氏菌 65 bp 與金黃色葡萄球菌 166 bp 條帶相對暗一些,故對 4 組引物對的加入量進行優化。測得 1mL 蠟樣芽孢桿菌的核酸濃度為 52.649ng/μL, 對應菌落濃度為 1.5×107 CFU/mL;1mL 金黃色葡萄球菌的 核酸濃度為 14.245 ng/μL,對應菌落濃度為 108CFU/mL; 1 mL 志賀氏菌的核酸濃度為 357.78 ng/μL,對應菌落 濃 度 為 108 CFU/mL;1 mL 沙門氏菌的核酸濃度為 108.32 ng/μL,對應菌落濃度為 1.05×108 CFU/mL。用 ddH2O 10 倍梯度稀釋提取的 DNA 模板,取 0.8 μL 進 行多重 PCR,測定其檢出限。

3 討論

目前,普通 PCR 技術在食品檢測、疾控檢測中, 已經相當成熟,相對于傳統的生化特性檢測,有著快 速、特異、靈敏度高的特點。在簡單的 PCR 基礎上,多 重 PCR 融合了普通 PCR 方便、快捷的優點,加入多個 引物對,可進行多個菌種多個樣品的快速分析,簡單 易操作,無需昂貴的儀器和專業的實驗人員,也可進 行準確的分析,為快速發展的食品檢測行業,提供了 很好的理論和技術基礎。由于多重 PCR 是在同一反 應下進行的,節約成本,因此相對于常規的單重 PCR 來說,大大縮短的檢測時間,提高了檢測效率。食 品檢測的快速發展,多重 PCR 方法以其特異性強、靈 敏度高等優點被廣泛應用于食源性致病菌的快速檢 測中。



 


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